食品大腸菌群檢測常見問題

常用標準

（1）GB/T 4789.3-2003 食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群測定

（2）GB 4789.3-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數

（3）GB 4789.28-2013 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求

（4）GB 4789.1-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則

（5）GB 4789.41-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸杆科檢驗

（6）GB/T 27405-2008 實驗室質量控製規範 食品微生物檢測

（7）GB/T 16294-2010 醫藥工業潔淨室（區） 沉降菌的測試方法

常見問題及解答

1、食品中大腸菌群的檢測有兩個標準三種方法，該如何選擇呢？

A：依據產品標準的項目單位

1.1 若單位為CFU/g，則選擇GB 4789.3-2016第二法（平板計數法）

1.2 若單位為MPN/g，則選擇GB 4789.3-2016第一法（MPN計數法）

1.3 若單位為MPN/100g，則選擇GB/T 4789.3-2003。

2、MPN法3個適宜的連續稀釋度該怎樣選擇？

A：依據產品標準的項目標準值

2.1 若標準值為＜3.0MPN/g，則選擇0.1g、0.01g、0.001g三個稀釋度。

2.2 若標準值為≤30MPN/100g，則選擇1g、0.1g、0.01g三個稀釋度。

樣品采集

怎樣采樣，才能使樣品具有代表性？

這裏將樣品分為兩類：預包裝食品和散裝食品或現場製作食品

（1）對於預包裝食品

① 應采集相同批次、獨立包裝、適量件數的食品樣品，每件樣品的采樣量應滿足微生物項目檢驗的要求。

② 獨立包裝小於、等於1000g 的固態食品或小於、等於1000mL 的液態食品，取相同批次的包裝。

③ 獨立包裝大於1000mL 的液態食品，應在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體，使其達到均質後采集適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內作為一件食品樣品；大於1000g 的固態食品，應用無菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內作為一件食品樣品。

（2）對於散裝食品或現場製作食品

用無菌采樣工具從 n 個不同部位現場采集樣品，放入 n 個無菌采樣容器內作為 n 件食品樣品。每件樣品的采樣量應滿足微生物項目檢驗單位的要求。

培養基製備過程容易出現問題解答

1、異常現象一：培養基不凝固

原因分析：

①製備過程中過度加熱；

②低pH造成培養基酸解；

③稱量不正確；

④瓊脂未完全溶解；

⑤培養基成分未充分混勻。

2、異常現象二：pH不正確

原因分析：

①製備過程中過度加熱；

②水質不佳；

③外部化學物質汙染；

④測定pH時溫度不正確；

⑤pH計未正確校準；

⑥脫水培養基質量差。

3、異常現象三：顏色異常

原因分析：

①製備過程中過度加熱；

②水質不佳；

③pH不正確；

④外來汙染；

⑤脫水培養基質量差。

4、異常現象四：產生沉澱

原因分析：

①製備過程中過度加熱；

②水質不佳；

③脫水培養基質量差；

④pH計未正確控製。

5、異常現象五：培養基出現抑製/低的生長率

原因分析：

①製備過程中過度加熱；

②脫水培養基質量差；

③水質不佳；

④使用成分不正確，如：成分稱量不準，添加劑濃度不正確；

⑤製備容器或水中的有毒殘留物。

6、異常現象六：選擇性差

原因分析：

①製備過程中過度加熱；

②脫水培養基質量差；

③配方使用不對；

④添加成分的加入不正確，例如加入添加成分時培養基過熱或添加濃度錯誤；

⑤添加劑汙染。

7、異常現象七：汙染

原因分析：

①不適當的滅菌；

②無菌操作技術存在問題；

③添加劑汙染。

實驗過程

1、平板法VRBA傾注完，待瓊脂凝固後為什麼需要加3-4mL的覆蓋層？

A：因為大腸菌群是需氧及兼性厭氧的，再加一層瓊脂相當於造就一個半厭氧環境，促進兼性厭氧菌的生長，同時抑製其他菌的生長。除此之外，還有防止菌落蔓延的作用，防止遷徙性菌落對菌落計數構成影響。例如一些變形杆菌就會有遷徙現象，從而導致菌落長成一片無法區分。在表麵多覆蓋一層培養基就可以避免這種情況的發生。

2、GB 4789.3-2016平板法驗證菌落如何挑取？

A：分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落數。按比例挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少於10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個，典型大腸菌群有6個。證實實驗應該按照可疑跟典型5:3的比例進行挑取，移種於BGLB肉湯管內。

結果處理

1、所有稀釋度都不在計數範圍內怎麼辦？

這種情況一般都是最低稀釋度的平板都小於15CFU，這種情況就是以最低稀釋度的平板菌落數乘以驗證試驗的比例來計算。例如10倍稀釋的兩個平板上菌落數分別為10、8，菌落數為10的平皿挑取10個菌落複發酵中有8個菌落產氣，菌落數為8的平皿挑取8個菌落複發酵中有7個菌落產氣，則計算過程是這樣的：（10*8/10+8*7/8）/2*10=75CFU/g（mL）。

2、連續兩個稀釋度的四個平皿的菌落數都在計數範圍內怎麼辦？

這個需要參考菌落總數檢測國標裏7.1.2裏的公式計算。我們需要先計算每個平皿的驗證後的菌落數，再代入公式計算即可。例如10倍稀釋度兩個平皿菌落數為120和125，100倍稀釋度兩個平皿的菌落數為17和16，經過複發酵驗證產氣的管數分別為7、8、8、8，則我們先計算每個平皿上的菌落數分別為120*7/10=84，125*8/10=100，17*8/10=13.6（我們計14），16*8/10=12.8（我們計13），然後將84、100、14、13四個數代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，結果應報告960CFU/g（mL）。

3、隻有一個稀釋度的一個平皿的菌落數在計數範圍，其他均不在計數範圍怎麼辦？

這樣我們隻需要複發酵驗證這一個平皿即可，根據這一個平皿的菌落數進行報告。例如10倍稀釋度兩個平皿菌落數為160和142，100倍稀釋度兩個平皿的菌落數為12和13，則我們隻需要從菌落數為142CFU的平皿裏挑取10個菌落進行複發酵驗證即可，假如共有7支發酵管陽性，則應計算142*7/10=99.4，結果報告990CFU/g（mL）。

注意：對於結果檢出的平板或試管需要經過無害化處理（121℃滅菌30分鍾）方能棄去，防止對環境造成汙染。